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摘要：本文应用SCoT 和ISSR 标记从DNA 36份龙眼资源和1份龙荔的遗传多样性进行分析。12 对SCoT 引物共扩增出127条带，平均每条引物扩增10.58 条带；15 条ISSR 引物共扩增出117 个条带，平均拉增7.8 条带。UPGMA 聚类结果表明：SCoT 标记和ISSR 标记分别在相似系数0.672和0.685水平上，均可将37份材料分成6 大类群，SCoT 和ISSR 标记都适用于龙眼材料的遗传多样性分析，如果将两种标记的数据进行综合分析，可以缩小单一标记的误差。研究结果为龙眼种质资源的保存和利用提供了重要的依据。
论文关键词：龙眼,遗传多样性
龙眼(DimocarpuslonganaLour.)是无患子科(Sapindaceae)龙眼属植物，是热带、亚热带重要果树。在我国福建、广东、广西、四川、云南、贵州、海南及台湾等地都有大面积种植。龙眼原产于我国的广西、云南、海南和越南北部,中国
2008年Collard和Mackill在水稻上提出一种基于SPAR的新的目的基因分子标记方法，即SCoT分子标记。其具有多态性丰富、操作简单、成本低廉、引物可以通用等特点，并且能有效的产生与性状联系的标记，有利于辅助育种。ISSR分子标记是ZIETKIEWICZE等提出的一项基于微卫星序列的DNA分子标记技术。它结合了RAPD和SSR的优点，具有很好的稳定性和多态性，其产物多态性丰富、模板需要用量少、操作简单等特点。
长期以来，研究人员主要运用形态学等植物学特征特性对龙眼资源进行分类研究。虽然近年来国内外在运用分子标记对龙眼资源进行分类研究已有不少报道，但主要局限于栽培品种上。研究实生龙眼资源遗传多样性和亲缘关系的报道较少。为此，本实验借助SCoT和ISSR分子标记技术主要以中越边境中国境内实生龙眼和引入我国的越南、泰国龙眼资源为材料，进行遗传多样性分析和评价。旨在为搞清其遗传多样性程度及其变异情况,为实生龙眼和国外龙眼资源的开发利用打下基础。
1材料与方法
1.1材料
试验于2008年8月-2009年10月在广西作物遗传改良重点实验室进行。供试材料为37份龙眼种质，其中云南10份材料主要采自云南热带作物研究所；越南种质7份和泰国种质6份及四季蜜、龙荔采自广西农业科学院园艺研究所；广西地区种质11份均来源于各材料的原产地（具体见表1）。取样试材为幼嫩叶片，置于液氮中运回实验室放在-80℃的超低温冰箱中备用。试验试剂10xbuffer(含Mg)、dNTPs、TaqDNA聚合酶等购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.2试验方法
1.2.1DNA提取与检测参照陈虎等的改良CTAB法提取DNA，用紫外分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度，将提取的DNA稀释为30ng·μL，于-20℃冰柜中保存备用。
1.2.2引物筛选SCoT引物采用Collard和Mackill公布的36条引物序列和我们课题组自己设计的40条引物，ISSR所用引物参照加拿大哥伦比亚大学UBC公司公布的100条引物序列，均由上海生物工程合成。在BiometraTprofessionalPCR仪上进行筛选，从所有引物中筛选出扩增产物条带清晰，多态性好的12条SCoT引物和15条ISSR引物引物(表2)，用于所有DNA样品扩增。
1.2.3PCR扩增ISSR和SCoT都为20μl反应体系，包括DNA(30ng·μL)1.0μL、10×buffer(含Mg)2.0μl、4.0mmol.LdNTP0.5μL、30μmol.L引物1μl、DNA聚合酶(2U·μL)0.5μL，加水至20μL。ISSR和SCoT采用相同的反应程序：94℃预变性4min；95℃变性50S，复性退火温度随引物而定40S，72℃延伸2min，循环35次；72℃延伸10min。取5μl扩增产物在1.5%的琼脂糖电泳分离，电压为5V.cm,电极缓冲液为1×TAE,电泳结束后用EB染色，在紫外分析仪上观察并照相。
1.3数据分析方法
根据分子标记的迁移率及其有无，统计所有的二元数据。按条带有或无赋值，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，缺失记为“9”，记录清晰、稳定的扩增带输入计算机。采用NTsys2.10软件计算进行遗传相似性系数计算，在遗传相似系数矩阵的基础上,用UPGMA方法对37份材料进行聚类分析,同时进行主坐标分析检验聚类结果。
2结果与分析
2.1试验材料指纹图谱的建立
从76个SCoT引物中筛选到扩增效果好的12条引物，对供试的37份材料进行PCR扩增与检测，共扩增出127个DNA位点,其中108个位点具有多态性,占总位点的85.04％,说明供试的样品遗传多样性比较丰富。每条引物可扩增出S-16条带,平
均扩增10.58条带(表2)。产物条带在150-2100bp都有分布。建立37份材料的SCoT指纹图谱，部分引物的扩增结果见图1a。
用15对ISSR引物在供试的37份样本进行扩增，共扩增出117个基因位点,每对引物检测出5-12个等位基因,平均7.8个,检测等位基因数最多的是引物UBC810,最少的是引物UBC881。其多态性位点的扩增片段大小为300-2000bp（图1b），多态位点93个,占总条带的79.5%。比较ISSR和SCoT扩增的平均条带数和多态性条带比率,均为SCoT标记多于ISSR分子标记。
2.1SCoT标记聚类分析
按UPGMA方法构建了亲缘关系树状图（图2a）
由图可见,在遗传相似系数为0.672的水平上,将37份材料分为6组，其中四季蜜归为第1组。来自云南的云南-1、2、11归为第3组，越南V2为第四组，云南-9为第5组，龙荔为第6组。剩余30份材料归为2组。第2组在遗传相似系数为0.748水平有分为5个亚组，来自灵山的6份材料和崇左的2份材料及云南材料云南-3、6、7为第1亚组。来自泰国的6份材料归为第2亚组。那陈的2份材料为第3亚组。云南材料云南-4、5、8、10为第4亚组。除越南V2外的5份越南材料和龙州-1为第5亚组。
2.2ISSR标记聚类分析
利用UPGMA方法对SCoT扩增的结果构建聚类树状图(图2b)。由图可见,在遗传相似系数为0.685的水平上,除云南-4、8、9、泰国-3外，将其它32份材料分为6组。四季蜜为第1组，云南-5为第3组，那陈2份材料，崇左2份材料及龙州1份材料和越引-1，依登为第4组。云南-1、2、11为第5组。龙荔为第6组。其余材料为第2组。在遗传相似系数为0.727时将第2组分为5亚组。云南-3为第1亚组。来自灵山的6份材料为第2亚组。云南-3、7、
10和越南V3为第3亚组，来自越南的越南-2、3、4越南V1，V2为第4亚组。来自泰国的依器，苗翘及泰国-1、2为第5亚组。
2.3SCoT和ISSR标记综合分析
把SCoT和ISSR两种标记分析的数据综合后，37份材料的聚类分析结果如图3a所示，在相似系数0.715水平上，除云南-5外，可以将36分材料划分为6大类群。栽培品种四季蜜为第1组。云南-8、9为第3组，云南-1、2、11为第4组。云南-3、4为第5组。龙荔为第6组。其余材料为第2组。在遗传相似系数为0.745是将第2组分为5亚组。云南-6、7、10和灵山6份材料为第1亚组。越南的7份材料和泰国依登为第2亚组。来自泰国的泰国-1、2、3及泰国依器和苗翘为第3亚组。那陈2份材料为第4亚组。来自崇左的2份材料和龙州的材料为第5亚组。
 
 
2.4基于SCoT和ISSR综合数据的主坐标分析
为了更好地反映材料间的亲缘关系，进行主坐标分析(图3b),所反映的结果与UPGMA聚类分析结果相似。第一、第二、第三主坐标贡献率分别为8.42%、7.40%和6.56%。
 
3讨论
3.1SCoT和ISSR分子标记结果比较
本实验用12条多态性好的SCoT引物，平均每条扩增10.58条带，共扩增出127个DNA位点,其中108个位点具有多态性,占总位点的85.04％,说明供试的样品遗传多样性比较丰富。另外本试验选用的15条多态性高的ISSR引物，平均每条引物扩增7.8条带。平均多态率达到79.5％。显示了ISSR标记的高效性。从聚类图中可以看出，无论是SCoT分子标记还是ISSR分子标记数据的聚类图基本可以将供试材料分开。两种结果虽有一定的差异，但是从总体上来看结果大致相同。说明SCoT和ISSR分子标记是进行龙眼种质遗传多样性分析和亲缘关系分析中的有效工具。如果将两种标记方法综合分析，这样将进一步缩小了单一标记的误差，取得更加准确的实验结果。
3.2龙眼种质资源的遗传多样性与亲缘关系
本实验中的龙眼SCoT和ISSR扩增结果表明，龙眼的遗传相似系数在0.518-0.896和0.617-0.975，平均为0.707和0.796，说明供试龙眼种质的遗传多样性并不是很高，这与许奇志，易干军等的研究结果类似。在两种标记中崇左-1和崇左-2的遗传相似系数都为最高，可能是在这个区域龙眼种质没有与外界发生交流。通过本研究还可以看出，云南材料遗传分化较大，并且在遗传距离上相差较远。造成这一现象可能因为云南作为世界龙眼起源中心之一，种质资源丰富，分布范围广，这些特性都有利于遗传变异的产生和保持，促进了居群之间基因的频繁交流，从而使云南龙眼资源产生丰富的遗传多样性。这与柯冠武,高慧颖等的研究结果相同。来自越南和泰国的国外材料基本上按各自来源聚类，这与高慧颖，曾黎辉，钟凤林,彭宏祥等的研究结果一致，但本实验中有个别国外材料和中国材料有交叉现象，可能是由于在其它研究中国外材料较少而本实验采用较多的国外材料有关。从本实验的聚类结果可以看出，大部分材料按地理分布聚到一起。但是，有些不同产地材料地理距离远而遗传距离却比较相近，这可能是由于人为交流，造成种质材料交流，因此本实验认为不能简单按地区单独聚类。
3.3特殊种质
对四季蜜的起源，大部分研究者抱审慎态度，因此一直没有可靠定论。本实验的SCoT分子标记结果显示四季蜜与云南-10亲缘关系最近，而ISSR分子标记结果显示四季蜜与云南-7的遗传相似系数最高，将两种分子标记的数据综合进行分析，结果四季蜜与龙州-1遗传相似系数最高，为0.734，其次云南-10相似系数为0.732。 |
因此，本实验结果认为四季蜜可能起源于云南。这与钟伟等研究结果不一致。要进一步确认热带龙眼及四季蜜的起源，还需采集更多代表基因型与分子标记技术相结合进行研究。龙荔与龙眼是同属不同种的近缘种，且为半野生种。本实验分析发现，龙荔与泰国依登和苗翘亲缘关系最近，但相似系数都没有大于0.700。SCoT分子标记聚类图中龙荔并不是在遗传相似系数最低的时候分开的，这可能是由于SCoT分子标记能产生与性状联系的特点有关。
4结论
利用SCoT和ISSR分子标记技术对国内外龙眼种质资源DNA的遗传多样性进行了检测，两种分子标记都可以把37份龙眼材料区分开，可以作为龙眼分类的有力工具。UPGMA聚类分析表明，中国的龙眼种质遗传多样性较高，泰国和越南较低。
致谢：本文对材料收集过程给予帮助的云南农业科学院热带经济作物研究所黄家雄研究员和其他专家，谨此一并致谢。 |
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